Buněčný receptor c-kit je počátkem signální dráhy, která má význam pro vývoj krvetvorných kmenových a progenitorových buněk, melanocytů a pro spermatogenezi. Inaktivační mutace c-kit má za následek poruchu hematopoezy, která se projevuje anémií a nedostatkem kmenových a progenitorových buněk. Pokusným myším, postižených takovou poruchou, Lze transplantovat kostní dřeň aniž by příjemci byli ozářeni nebo jim byla podávána cytostatika. Ligandem receptoru c-kit je cytokin ,,Stem Cell Factor". Aktivovaný c-kit má tyrosinkinázovou aktivitu. Výzkum bude zaměřen na úlohu signalizace c-kit receptorem při přichycení a rozvoji transplantátu krvetvorné tkáně. Využity budou inhibitory tyrozinkináz, které byly vyvinuty pro léčbu chronické myeloidní leukémie a které tlumí signalizaci receptorem c-kit.

Chang KT, Sefc L, Psenak O, Vokurka M, Necas E.: Early fetal liver readily repopulates B lymphopoiesis in adult bone marrow. Stem Cells.

Regulace železa v organismu: studium genové exprese

Školitel: doc. MUDr. Martin Vokurka, CSc., mvokulf1.cuni.cz / Ing. Jan Krijt, Ph.D., jkrilf1.cuni.cz / prof. MUDr. Emanuel Nečas, DrSc., necascesnet.cz

Železo je kovový prvek, který má v organismu několik zásadních funkcí a naopak ve volné formě je pro buňky toxický. Jeho regulace na úrovni organismu i buněk musí být v souladu s potřebami a zásobami a nebyla dosud zcela objasněna. V posledních několika letech byly objeveny nové proteiny, které se jí účastní na úrovni transportu či regulace (hepcidin, transferinové receptory 1 a 2, DMT1, Dcytb, ferroportin, hephaestin, frataxin, HFE, hemojuvelin apod.), přičemž u některých z nich nejsou všechny funkce dosud poznány a ani není zcela známa jejich přesná regulace. Zejména jaterní peptid hepcidin je považován za klíčový regulátor jak resorpce železa v duodenu, tak jeho kinetiky uvnitř organismu mezi zásobárnami a krvetvornou tkání, a mohl by najít výrazné uplatnění i v klinické praxi. Má m.j. význam pro vznik anémie chronických chorob, která doprovází zánětlivá a nádorová onemocnění, selhání ledvin apod. Na našem ústavu sledujeme genovou expresi těchto proteinů v situacích s experimentálně navozenými změnami kinetiky železa, při změnách erytropoezy, zánětové a nádorové stimulaci aj. Těžiště projektu bude spočívat v aplikaci metod molekulární a buněčné biologie (PCR v reálném čase, Western blot, ELISA, MALDI-TOF-TOF). Využívány budou experimentální zvířecí modely, ev. buněčné kultury. Je možné i propojení s klinicky orientovaným výzkumem.

Publikace:

Vokurka M., Krijt J.., Vávrová J., Nečas E: Hepcidin expression in the liver of mice with implanted tumor reacts to iron deficiency, inflammation and erythropoietin administration. Folia Biologica 2011, vol. 57: 248-254

Vokurka M, Lacinová Z, Křemen J, Kopecký P, Bláha J, Pelinková K, Haluzík M, Nečas E.: Hepcidin expression in adipose tissue increases during cardiac surgery. Physiol Res. 2010;59(3): 393-400

Krijt J., Fujikura Y, Šefc L, Vokurka M, Hlobeňová T, Nečas E: Hepcidin downregulation by repeated bleeding is not mediated by soluble hemojuvelin. Physiol. Res. 2010, vol. 59(1): 53-59

Krijt J., Niederkofler V., Salie R., Šefc L., Pelichovská T., Vokurka M., Nečas E.:Effect of phlebotomy on hepcidin expression in hemojuvelin-mutant mice. Blood Cells Mol Dis. 2007, vol 39, 92-95

Krijt J., Vokurka M., Šefc L., Ďuricová D., Nečas E.: Effect of Lipopolysaccharide and Bleeding on the Expression of Intestinal Proteins Involved in Iron and Haem Transport. Folia Biologica, 2006, vol. 52, p. 1-5

Vokurka M., Krijt J., Šulc K., Nečas E.: Hepcidin mRNA levels in mouse liver respond to inhibition of erythropoiesis. Physiol. Res., 2006, vol. 55, p. 667-674

Krijt J., Vokurka M., Chang K.T., Nečas E.: Expression of Rgmc, the murine ortholog of hemojuvelin gene, is modulated by development and inflammation, but not by iron status or erythropoietin. Blood, 2004, vol. 104, p. 4308-4310

Krijt J., Čmejla R., Sýkora V., Vokurka M, Vyoral D, Nečas E: Different expression pattern of hepcidin genes in the liver and pancreas of C57BL/6N and DBA/2N mice. J Hepatol., 2004, vol. 40, p. 891-896

Leukemické kmenové buňky a progenitory

Myeloidní leukémie jsou maligní onemocnění hematopoetických progenitorových/kmenových buněk klonálního charakteru. Ačkoli bylo doposud identifikováno mnoho genových mutací, jejichž role na patofyziologii leukemogeneze byla částečně objasněna, zůstávají příčiny a molekulární mechanismy vzniku leukémie z větší části neznámé. Model lidské hematopoézy po xenotransplantaci lidských krvetvorných buněk do imunodeficientních myší představuje obvyklý model pro studium lidské hematopoetické kmenové buňky. Tento model umožňuje studovat senzitivitu normálních a patologických lidských hematopoetických kmenových buněk na různé faktory zevního prostředí, včetně testování experimentálních terapeutických postupů. Cytokiny typu TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) mohou mít eminentní význam pro kontrolu maligního klonu při progresi leukemického onemocnění. TRAIL by mohl být účinnou součástí terapeutických kombinací při léčbě leukémie.

Témata postgraduálních (PhD práce) a pregraduálních (diplomová práce) projektů:

Identifikace a modulace preferenční signální dráhy TRAILem indukované apoptózy u primárních leukemických buněk.

Objasnění vlivu faktorů s potenciální schopností modulovat senzitivitu na TRAILem indukovanou apoptózu leukemických buněčných linií a primárních leukemických kmenových buněk.
Projekty jsou podpořeny granty IGA MZ a GA UK.

Plasilova M, Zivny J, Jelinek J, Neuwirtova R, Cermak J, Necas E, Andera L, and Stopka T.: TRAIL (Apo2L) suppresses growth of primary human leukemia and myelodysplasia progenitors. Leukemia 16, 67-73, 2002.

Zivny J, Jelinek J, Pospisilova D, Plasilova M, Necas E, and Stopka T.: Diamond blackfan anemia stem cells fail to repopulate erythropoiesis in NOD/SCID mice. Blood, Cells, Molecules, and Diseases, accepted, 2003.

MacFarlane M.: TRAIL-induced signalling and apoptosis. Toxicology Letters 139 (2003) 89-97

Experimentální terapie leukémie a lymfomu; studium mechanismů látkové rezistence

Imunodeficientní myši představují model pro xenotransplantaci a následné in vivo studium celé řady lidských nádorových onemocnění, včetně leukémií a lymfomů. Zvířecí model umožňuje studovat efekt různých terapeutických strategií na leukemické / lymfomové kmenové buňky, na engraftment, růst a metastazování lidských leukemických / lymfomových buněk v myším organismu nebo na novotvorbu cév u pokročilého onemocnění. Navíc umožňuje plnohodnotně testovat ty látky, jejichž účinek in vitro je omezený až nulový (většina monoklonální;ch protilátek, neaktivní prekurzory účinných látek, např. cyklofosfamid aj.) Prvořadým cílem experimentální terapie je prodloužit celkovou délku přežití modelového organismu. Projekt je zaměřen na testování terapeutických režimů kombinujících standardně užívané a experimentální protinádorové látky s cílem identifikovat kombinace s maximálním cytotoxickým účinkem vůči leukemickým / lymfomovým buňkám a minimální toxicitou vůči zdravým tkáním. Dalším cílem projektu je identifikovat molekulárními mechanismy, které jsou zodpovědné za rozvoj rezistence leukemických a lymfomových klonů vůči terapii.

Makram Merimi, Pavel Klener, Maud Szynal, Yvette Cleuter, Gaëlle Wymeersch, Pierre Kerkhofs, Arsene Burny, Philippe Martiat and Anne Van den Broeke: Suppression of viral gene expression in Bovine Leukemia Virus-1 associated B-cell malignancy: interplay of epigenetic modifications leading to chromatin with a repressive histone code; J Virol 2007

P. Klener jr., L. Anděra, P. Klener, E. Nečas, J. Živný: Cell Death Signalling Pathways in the Pathogenesis and Therapy of Haematologic Malignancies: Overview of Therapeutic Approaches, Folia Biologica (Praha) 52, 119-136 (2006)

Klener P., Szynal M., Cleuter Y., Merimi1 M., Duvillier H., Lallemand F., Bagnis C., Griebel P., Sotiriou Ch., Burny A., Martiat P., and Van den Broeke A.: Insights into gene expression changes impacting B-cell transformation: cross-species microarray analysis of BLV Tax-responsive genes in ovine B-cells, J Virol, accepted 2006

Fuchs O, Simakova O, Klener P, Cmejlova J, Zivny J, Jelinek J, Zavadil J, Stopka T: Inhibition of Smad5 in Human Hematopoietic Progenitors Blocks Erythroid Differentiation Induced by BMP4, Blood Cells Mol Dis. 2002

Studium chromatinu v rozhodovacích procesech normální a leukemické krvetvorby

Výzkum v mé skupině je zaměřen na identifikaci mechanismů transkripční regulace normální a leukemické krvetvorby. Tyto mechanismy zahrnují vzájemné interakce liniově specifických transkripčních faktorů a DNA, jež je zabalená do nukleoproteinové struktury označované jako chromatin. Asociace transkripčních faktorů a DNA v buněčném jádře je závislá na remodelaci chromatinu, jež je uskutečňována ATP-dependentním mechanismem proteiny z rodiny SWI/SNF. PhD projekty obsahují následující přístupy: genová inaktivace v myši (gene knockout), transientní a stabilní genetické manipulace v leukemických buňkách, globální analýzy genové exprese a chromatinové struktury.

Epigenetic silencing of the oncogenic miR-17-92 cluster during PU.1-directed macrophage differentiation. Pospisil V, Vargova K, Kokavec J, Rybarova J, Savvulidi F, Jonasova A, Necas E, Zavadil J, Laslo P, Stopka T. EMBO J. 2011 Sep 6. IF: 10.2

MYB transcriptionally regulates the miR-155 host gene in chronic lymphocytic leukemia. Vargova K, Curik N, Burda P, Basova P, Kulvait V, Pospisil V, Savvulidi F, Kokavec J, Necas E, Berkova A, Obrtlikova P, Karban J, Mraz M, Pospisilova S, Mayer J, Trneny M, Zavadil J, and Stopka T. Blood. 2011 Apr 7;117(14):3816-25. IF:10.555

Burda Pavel, Laslo Peter, and Stopka Tomas. Transcription factors PU.1 and GATA-1 and leukemia differentiation. Leukemia. 2010 Jul;24(7):1249-57. IF: 8,634

Burda P, Curik N, Kokavec J, Basova P, Mikulenkova D, Skoultchi AI, Zavadil J and Stopka T. PU.1 Activation Relieves GATA-1–Mediated Repression of Cebpa and Cbfb during Leukemia Differentiation. Mol Cancer Res 2009, 7(10): OF1-11. October IF: 4,533

Chong S, Vickaryous N, Ashe A, Zamudio N, Youngson N, Hemley S, Stopka T, Skoultchi A, Matthews J, Scott HS, de Kretser D, O'Bryan M, Blewitt M, Whitelaw E. Modifiers of epigenetic reprogramming show paternal effects in the mouse. Nat Genet. 2007 May;39(5):614-22, IF2007 25,556

Yang Y, Stopka T, Golestaneh N, Wang Y, Wu K, Li A, Chauhan BK, Gao CY, Cveklová K, Duncan MK, Pestell RG, Chepelinsky AB, Skoultchi AI, Cvekl A. Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin. EMBO J. 2006 May 17;25(10):2107-18, IF2006 10.086

Plasticita kmenových buněk z kostní dřeně

V kostní dřeni se nacházejí kmenové buňky, které je možné izolovat na základě jejich povrchových znaků a některých dalších parametrů. Po transplantaci dokáží kolonizovat kostní dřeň příjemce a jsou zodpovědné za dlouhodobé přihojení štěpu. V nedávné době byla publikována řada prací prokazujících plasticitu těchto buněk a možnost jejich transdiferenciace do buněk mnoha dalších tkání. Budeme sledovat vliv proliferace štěpu na přihojení transplantovaných kmenových buněk a jejich podíl na hojení poškozených nehematologických tkání (srdce, ledviny, játra, nervová tkáň). K detekci budou použity buňky transgenních myších linií s molekulárními markery.

>Chang K-T, Šefc L, Pšenák O, Vokurka M, Nečas E. Early fetal liver readily repopulates B-lymphopoiesis in adult bone marrow. Stem Cells 2005; 23: 230-239

Šefc L, Pšenák O, Sýkora V, Šulc K, Nečas E. Response of hematopoiesis to cyclophosphamide follows highly specific patterns in bone marrow and spleen. J Hematotherapy Stem Cell Res. 2003; 12: 47-62

Pšenák O, Šefc L, Sýkora V, Chang KT, Nečas E. Cytokine Gene Expression in Regenerating Haematopoietic Tissues of Mice after Cyclophosphamide Treatment. Acta Haematol 2003; 109: 68-75

Pomyje J, Živný J, Šefc L, Plášilová M, Pytlík R, Nečas E. Expression of genes regulating angiogenesis in human circulating hematopoietic cord blood CD34+/CD133+ cells. Eur J Haematol 2003; 70: 143-150

Afinitní proteomika: Afinitní chromatografie na magnetických nosičích

Afinitní proteomika je mladý obor, který se zabývá interakcemi mezi bílkovinami a dalšími molekulami ( inhibitory, protilátky atd.), které jsou důležité pro jejich funkci. Jednou z metod, která umožňuje vztahy mezi jednotlivými molekulami studovat je afinitní chromatografie. V naší laboratoři se zabýváme vazbou protilátek, derivátů substrátů enzymů a jejich inhibitorů na nerozpustné magnetické i nemagnetické nosiče a studiem podmínek adsorpce bílkovin k takto modifikovaným nosičům. Tímto způsobem je možno studovat interakce zkoumaných bílkovin za normálních a patologických podmínek, a také navrhovat nové diagnostické metody pro detekci bílkovin.

Frýdlová J, Kučerová Z , Tichá M :Interaction of pepsin with aromatic amino acids and thein derivatives immobilized to Sepharose Journal of Chromatography B, 863 (2008) 135–140

Novotna L, Hruby M, Benes MJ, Kucerova Z.: Study of pepsin phosphorylation using immobilized metal affinity chromatography J Sep Sci. 31(2008)1662-8

Zatloukalová E., Kučerová Z.: Immunoaffinity carrier prepared by immobilization of
antibody via Co3+-chelate J. Sep. Sci 29 (2006) 1082 – 1087.

Přikryl P, Horák D, Tichá M, Kučerová Z.: Magnetic IDA-modified hydrophilic methacrylate-based polymer microspheres for IMAC protein separation J. Sep. Sci 29 (2006) 2541-2549

Proteomika jako nástroj k odhalování molekulárních mechanismů závažných onemocnění.

Moderní proteomické techniky umožňují studium kvantitativních i kvalitativních změn proteomu a tedy i popis patologických procesů na molekulární úrovni. Pomocí citlivých elektroforetických a chromatografických separačních technik kombinovaných s hmotnostní spektrometrií můžeme současně monitorovat expresi a modifikace stovek až tisíců bílkovin. Těmito proteomickými přístupy studujeme například rezistenci leukemických buněk k novým cytostatikům, procesy regulace diferenciace buněk, růst transplantovaných nádorů a také molekulární patofyziologii srdečního selhání. Usilujeme rovněž o nalezení nových diagnosticky využitelných nádorových markerů v séru pacientek s gynekologickými malignitami.

| PROTOEMIKA | HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE |

Petrak J, Toman O, Simonova T, Halada P, Cmejla R, Klener P, Zivny J., Identification of molecular targets for selective elimination of TRAIL-resistant leukemia cells. From spots to in vitro assays using TOP15 charts. Proteomics. 2009 Nov;9(22):5006-15.

Peslova G, Petrak J, Kuzelova K, Hrdy I, Halada P, Kuchel PW, Soe-Lin, S, Ponka P, Sutak R, Becker E, Huang ML, Rahmanto YS, Richardson DR, Vyoral D., Hepcidin, the hormone of iron metabolism, is bound specifically to alpha-2-macroglobulin in blood. Blood. 2009 Jun 11;113(24):6225-36.

Petrak J, Ivanek R, Toman O, Cmejla R, Cmejlova J, Vyoral D, Zivny J, Vulpe CD. Déja vu in proteomics. A hit parade of repeatedly identified differentially expressed proteins. Proteomics 2008, 8(9):1744-9.

Petrak J, Myslivcova D, Halada P, Cmejla R, Cmejlova J, Vyoral D, Vulpe CD. Iron-independent specific protein expression pattern in the liver of HFE-deficient mice. Int J Biochem Cell Biol. 2007,39(5):1006-15.

Petrak J, Myslivcova D, Man P, Cmejla R, Cmejlova J, Vyoral D, Elleder M, Vulpe CD. Proteomic analysis of hepatic iron overload in mice suggests dysregulation of urea cycle, impairment of fatty acid oxidation, and changes in the methylation cycle. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2007, 292(6):G1490-8.

Studium funkčních proteinových komplexů

Většina bílkovin v buňce nepůsobí v izolaci, ale jako součást velkých proteinových komplexů (nukleosomy, ribosomy, jaderné póry, respirační mitochondriální komplexy).
Tento projekt je zaměřen na studium složení a funkce proteinových komplexů, které se uplatňují v metabolismu kovů.
K purifikaci takových komplexů jsou využívány nedenaturující separační techniky, umožňující zachování jejich struktury. K identifikaci jednotlivých bílkovinových komponent pak používáme metody hmotnostní spektrometrie proteinů.

Babusiak M, Man P, Sutak R, Petrak J, Vyoral D.: Identification of heme binding protein complexes in murine erythroleukemic cells: Study by a novel two-dimensional native separation - liquid chromatography and electrophoresis. Proteomics. 2005 Feb; 5(2):340-50.

Vyoral D, Petrak J.: Iron transport in K562 cells: a kinetic study using native gel electrophoresis and 59Fe autoradiography, Biochim Biophys Acta 1998, 22;1403:179-88).

Vyoral D, Petrak J.: Detection and quantitation of 59Fe-labeled proteins using storage phosphorimaging. Anal Biochem, 1998, 15; 260:103-6.

Kódování v centrálním nervovém systému - matematické modelování

Školitel: doc. MUDr. RNDr. Petr Maršálek, Ph.D., marsalekkarlin.mff.cuni.cz

Stačí porovnat současný stav porozumění genetickému kódu se stavem popisu kódování událostí v centrálním nervovém systému pomocí akčních potenciálů. Stav poznání kódu, který byl v genetice před padesáti lety, je nyní v neurovědách. To je třeba změnit. Je to výzva pro teoretickou biofyziku v neurovědách. Pro úvod do časové přesnosti akčních potenciálů viz: MARŠÁLEK et al, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 737-740.

MARŠÁLEK P., KOCH C. a MAUNSELL J., 1997, On the relationship between synaptic input and spike output jitter in individual neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 735–740.

MARŠÁLEK P. a SANTAMARÍA F., 1998, Investigating spike backpropagation induced Ca2+ influx in models of hippocampal and cortical pyramidal neurons. BioSystems, 48: 147–156.

KURIŠČÁK E. a MARŠÁLEK P., 2004, Model of neural circuit comparing static and adapting synapses. Prague Medical Report. 4:369-380

Modelování přenosu krevních plynů, poruch vnitřního prostředí, hemodynamiky a ledvin

Cílem disertační práce bude vytvořit a identifikovat modely popisující přenos krevních plynů, acidobazickou, elektrolytovou, osmotickou a objemovou homeostázu vnitřního prostředí, regulační vliv ledvin a uplatnění cirkulace za fyziologických i patologických podmínek. Tyto modely budou využity pro tvorbu lékařského trenažéru (simulátoru) určeného zejména pro akutní medicínu kritických stavů. Simulátor bude umožňovat sledování průběhu patofyziologických stavů na úrovni jednotlivých fyziologických subsystémů, dovolí rozpojit jednotlivé regulační smyčky a zkoumat jejich reakci odděleně od celého organismu. Práce bude navazovat na simulátor fyziologických funkcí organismu GOLEM, vytvořený na Biokybernetickém oddělení Ústavu patologické fyziologie. Další oblastí práce bude vytvoření modelů jednotlivých fyziologických subsystémů identifikovatelných na konkrétní měřená data pacientů v intezívní péči. Identifikací můžeme získat klinické informace, odvozené z dynamiky změn dat, které by klasickými vyšetřovacími postupy nebyly zjistitelné.
Pro výstavbu simulačních modelů používáme MATLAB/Simulink, pro vizualizaci a návrh uživatelských rozhraní MS Visual Studio .NET, Control Web, resp. Macromedia Flash pro tvorbu interaktivních multimediálních komponentů. Do postgraduálního studia se mohou hlásit absolventi lékařských fakult, matematicko-fyzikálních a také inženýrských oborů.

Kofránek J, Andrlík M, Kripner T.: Multimedia educational simulators in pathophysiology - how to design and why to use them. In: Gamal Attiya and Yskandar Hamam editors. Proceedings of the 5th EUROSIM Congress on Modeling and Simulation. Full Papers CD Volume.; Marne la Vallee, Paris, France: Eurosim - Francosim - Argesim; 2004. p. Simulation in Education 22 -27.

Kofránek J, Andrlík M, Matoušek S.: Simulation Model of O2 and CO2 Content and Blood Acid-Base Chemistry.; 2005; Aalborg, Denmark: European Society for Computing and Technology in Anaesthesia and Intensive Care; 2005. p. 15-16.

Kofránek J, Andrlík M, Kripner T, Stodulka P.: From Art to Industry: Development of Biomedical Simulators. The IPSI BgD Transactions on Advanced Research 1 #2[Special Issue on the Research with Elements of Multidisciplinary, Interdisciplinary, and Transdisciplinary: The Best Paper Selection for 2005], 62-67. 2005. New York, Frankfurt, Tokyo, Belgrad. 2005.

POSTGRADUÁLNÍ STUDIUM | PROTOEMIKA | HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE | Databáze cDNA | ODBORNÁ LITERATURA |

Věda, výzkum

.

Signalizace receptorem c-kit v transplantaci kostní dřeně.